我们的大多数毒液已经过纯化和鉴定。 在某些情况下，其他医学研究人员希望获得一定纯度的馏分。 为了提供这项服务，将对毒液进行纯化和鉴定。 将使用用于尺寸排阻，离子交换和反相的高效液相色谱（HPLC）。 HPLC为毒素分离提供了一种非常方便快捷的方法。 这种方法在NNTRC上普遍使用，并被证明是成功的（Khunsap等人，2011; Teklemariam等人，2011; Suntravat等人，2010; Da Silva等人，2009; Salazar等人，2009 ；Sánchez等人，2009； 2006； 2005；Galán等人，2008； Pineda等人，2008；Girón等人，2007）。 可能具有医学用途的分子，例如整联蛋白，C型凝集素，PLA2，蛇毒金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，将从食草白斑曲霉，金刚假丝酵母，绿色假丝酵母和绿色假丝酵母中分离出来。

从蛇毒中纯化分子的色谱步骤取决于其物理和化学特性。 这些方法通常在NNTRC上使用。 纯化整联蛋白的方法包括三个色谱步骤的组合：反相C18（Vydac），尺寸排阻和阴离子交换色谱（Sánchez等，2009； 2006； 2005；Galán等，2008）。

将浓度为25 mg / mL的适当缓冲液中的18微升冻干粗毒液注入Grace Vydac反相C4.6（250 x 0.1 mm）色谱柱中。 将使用80％三氟乙酸（TFA）和0.1％乙腈（ACN）的60％TFA梯度液在1分钟内以280 mL / min的流速洗脱级分。 蛋白质将在XNUMX nm处检测到。 将测试这些级分对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用

用反相C18色谱收集的抑制血小板聚集的馏分将通过尺寸排阻色谱进一步分级分离。 将60微升合并的馏分注入到Waters™高效液相色谱系统上的Waters™ProteinPak 7.8色谱柱（300 x 0.02 mm）中。 在6.2分钟内，以60 mL / min的流速使用pH值为0.5的280 M磷酸钠作为缓冲液。 蛋白质将在XNUMX nm处检测到。 将测试这些级分对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用。

使用尺寸排阻色谱法抑制血小板聚集的馏分将通过阴离子交换色谱法进一步分级分离。 将5微升合并的馏分上样至Waters HPLC上的Waters PROTEIN-PAKTM 7.5PW（75 x 0.02 mm）色谱柱中。 所用的缓冲液将为8.0 M Tris-HCl，pH 0.5，洗脱液含有60 M NaCl，历时1分钟，流速为280 mL / min。 蛋白质将在XNUMX nm处检测到。 将测试这些级分对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用以及其他解整合素测定，包括抑制细胞迁移，细胞粘附，转移和血管生成。

确定蛋白质和肽质量的最有效方法是质谱法。 这是NNTRC常用的方法（Khunsap等人，2011；Sánchez等人，2010； Salazar等人，2009；Galán等人，2008）。

蛋白质样品将在Eppendorf speedvac中于30°C干燥30分钟，重悬于10 L的0.1％TFA / 50％ACN中，并使用C18 Zip Tip（Millipore ZTC18S096）脱盐。 将在MTP AnchorChip目标板4/600 TF（Bruker Daltonics）上发现384纳升的氰基-0.5-羟基肉桂酸（Bruker Daltonics），并将2μL样品添加到基质上。 MALDI-TOF分析将使用正模式的Bruker AUTOFLEX II-TOF（Bruker Daltonics）执行。 包括胰岛素-5735.89，泛素-8573.6，cytochrom-12370.83，myoglobin-16948.86，cytochrome-6183.08和myoglobin-8459.67的肽标准品XNUMX（Bruker Daltonics）将在反射器模式下进行。

该研究项目将需要人类血液来筛选蛇毒中能阻断人血小板聚集的整联蛋白。 人血还将用于血琼脂平板中以检测磷脂酶。 血液将仅用作试剂，不会保留任何人类记录。 用于采血的所有材料将是无菌的且一次性使用。

在纯化之前和之后，将使用生物学测定来筛选毒液和毒液级分的出血性，蛋白水解性，纤维蛋白溶解性，纤维蛋白原分解和明胶酶活性。 另外，将使用包括阻断转移，血管生成和血小板聚集的那些的整联蛋白测定。 其他测定将用于更好地定义防止转移的肽的生物学功能。 血小板聚集测定和细胞结合测定通常在NNRCC进行。 在BALB / c小鼠中将筛选出具有减少肿瘤潜力的分子。

将进行一次出血测定，以确定哪些毒液和级分会引起出血。 我们通常使用Sánchez等人描述的改进方法。 （2011）确定粗毒液的最小出血剂量（MHD）。 将对每种毒液样品进行一系列稀释，其中每种稀释液的0.1 mL将被皮下注射到BALB / c小鼠的背部（n = 8）以测试活性。 24小时后，将小鼠处死。 将测量出血点（毫米）并确定MHD。 MHD定义为引起10mm出血点的毒蛋白的量。 获得结果后，将小鼠喂食蛇。

该测定已常规用于确认纤溶蛋白分子的纯化并筛选所有毒液的纤溶活性（Sánchezet al。，2005）。

将9.4微升纤维蛋白原溶液（10 mg / mL）和38.5 µL凝血酶溶液（24 U / mL）添加到3孔板的每个孔中，然后轻轻摇动。 板中的溶液将在室温下凝结。 然后将板在37℃下孵育37小时。 每孔添加10微升的一种毒液级分，并在10°C下孵育过夜。 将XNUMX微升的XNUMX％三氯乙酸（TCA）放入每个孔中，然后在XNUMX分钟后倒出。 通过将清除的直径（mm）除以每个孔中放置的蛋白质样品的量（µg），可以计算出特定的纤维蛋白溶解活性。

蛇毒含有数千种生物活性毒素的混合物，其中许多是具有酶促活性的成分。 Hide Powder天蓝色测定法是一种鉴定蛋白酶的廉价，快速，简便的技术。

Rinderknecht等人的改进方法。 （1968）将被用来测试蛋白水解活性。 将皮革粉天青粉用研钵和研杵研磨，以在添加稀释剂之前获得均匀的颗粒。 将2毫克精细研磨的生皮粉天青粉与0.02 mL 8.0 M pH 100的1 M Tris-HCl缓冲液混合，然后将37 µL每种毒液级分添加到小瓶中。 每个小瓶将在595°C下孵育XNUMX小时，并在XNUMX nm处测量吸光度。 通过将吸光度除以所用蛋白质的量（毫克）来计算比活。

明胶酶测定法是一种廉价，简单且快速的蛋白水解测定法，将用于筛选毒液，纯化的级分和cDNA表达的产物。 当在蛋白酶的特定抑制剂存在下使用丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶时，该方法将有助于鉴定它们。

由Huang和Pérez（1980）修改的方法将用于测试毒液级分的明胶酶活性。 每个蛇毒部分4微升将分别放置在带有明胶涂层的Kodak X-OMAT科学成像胶片上的不同位置。 X射线胶片上的明胶水解将通过在潮湿培养箱中于37°C孵育XNUMX小时后用自来水洗涤胶片来确定。

我们已经发表的数据表明该仪器可用于鉴定具有促凝，抗凝和抗血小板活性的蛋白质（Sánchez等，2010； Suntravat等，2010）。 血小板功能可用于筛选蛇毒中的整联蛋白。 玻璃床活化试验（从Sienco，Inc获得的gbACT + KIT）将用于监测毒液组分对凝血过程的影响。 在使用前，将至少37％的柠檬化人血孵育至5°C。 将总共​​13 µL 0.25 M CaCl2添加到gbACT + KIT比色皿的一侧，然后将10 µL相同摩尔浓度的双整合素或0.85％盐水（阴性对照）添加到比色皿的另一侧。 。 重组disisntegrin r-mojastin 1将用作阳性对照（Sánchez等，2010）。 加入两种溶液后，将360 µL柠檬酸血加入比色杯中，并激活分析仪。 数据将通过包含Mac OS X软件的iMac计算机上的Signature Viewer™程序3.1版进行收集。

凝集仪是确定全血中抗血小板聚集的有用仪器，但也可能表明存在抗整合素的物质，可以防止转移。 阳性分数将通过细胞粘附测定法确认。

将使用Chronolog™全血Lumi凝集计通过测量阻抗来监测对血小板聚集的抑制作用。 在与等量的10 M盐溶液一起使用之前，将在37°C下孵育5微升0.15％柠檬酸化的人血。 将十微升的毒液级分与血样在2ºC下孵育37分钟。 血小板聚集将通过10 µL ADP（终浓度10 µM）开始，并测量反映聚集百分比的阻抗百分比。 血小板凝集的抑制百分比将通过以下公式计算：[（CE / C] x100，其中C是对照的血小板凝集的单位（欧姆），E是血小板凝集的单位（欧姆）。实验部分，阴性对照将由全血与10 µL 0.15 M盐溶液温育组成，重组disisntegrin（r-mojastin 1）将用作阳性对照（Sánchez等，2010）。通过与对照剂量的激动剂（10 µM ADP）诱导的最大聚集进行比较，评估血小板聚集的百分比，并表示为50％抑制浓度（IC50），该浓度由各种拮抗剂浓度产生的剂量反应曲线确定

这是一种常规测试，通常用于测量X因子激活剂的活性。

如Suntravat等人所述，将使用因子Xa特异性生色底物S-2765来测试毒液或毒液级分中的因子X活化剂活性。 （2011年； 2010年）。 将溶解于Tris-EDTA缓冲液中的50微升合并的正常人柠檬酸盐血浆（37 mg / mL）在3°C下孵育25分钟。 然后，将添加2765μL生色底物S-30，并在25秒钟内混合。 将加入0.1μL的毒液或与等量的2 M CaCl37预混合的毒液级分，并在3°C下孵育20分钟。 反应将被405％的乙酸终止。 样品将在XNUMX nm处监测。 每个测试一式两份进行。

我们将利用NNTRC上现有的蛇资源来利用毒腺构建cDNA文库。 据估计，每年可以构建两个cDNA文库。 第一个将来自C. horridus蛇的毒腺。 将蛇从安乐死的蛇中解剖出来，并立即在液氮中冷冻。 cDNA文库构建的整个过程在我们的出版物中有详细介绍（Jia等，2008）。 通过使用RNeasy Mini试剂盒（美国加利福尼亚州瓦伦西亚的Qiagen公司），大约20 µg的腺体将用于提取总RNA。 根据制造商的说明，对Creator SMART cDNA文库构建试剂盒（Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，美国）进行细微修改，即可构建使用0.5μg总RNA的定向cDNA文库。 首先，将蛇毒腺中的总RNA（0.5 µg）进行逆转录，并使用PowerScript逆转录酶（Clontech）和CDSIII / 3'PCR引物（Clontech）在1°C下合成cDNA。 。 其次，将通过长距离（LD）聚合酶链反应（PCR）在iCycler热循环仪（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）上进行双链cDNA（ds cDNA）合成。 最后，将使用CHROMA SPIN-42色谱柱（Clontech）对消化的ds cDNA进行分级分离。 将每个级分400 µL的样品在3％琼脂糖/ EtBr凝胶上进行电泳，通过在紫外光下观察条带的强度来确定峰级分。 将这些级分合并为大，中和小尺寸的cDNA，浓缩并分别连接到pDNR-LIB载体（Clontech）中，在1.1°C过夜。 产生的连接反应将分别转化为一剂Electrocomp GeneHogs E.coli（Invitrogen Corporation，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）。 这三个文库（大号，中号和小号）将混合在一起，形成独特的蛇毒cDNA文库。 NNTRC通常使用所有程序（Jia等，16；Sánchez等，2008； Suntravat等，2010，未出版）。 cDNA克隆将被送至爱荷华州立大学的DNA设施，使用Applied Biosystems 2012xl DNA分析仪进行测序。

将使用cDNA克隆作为PCR模板进行PCR扩增全长基因。 PCR产物将在乙醇中于-80°C提取1小时并沉淀。 将沉淀物用70％乙醇洗涤，干燥，溶解在水中并亚克隆到pGEX-2T-4（GST）载体（Amersham Biosciences）中。 GST基因将被转化为XL蓝色感受态细胞。 将使用miniprep试剂盒提取质粒DNA，并用GST载体进行测序以确认符合读框的目的（Jia等，1； Jia and Perez，2009）。
确认的质粒GST基因将被转化到大肠杆菌BL21星中，得到BL21 / GST基因。 首先将重组菌株在含有Luria-Bertani（LB）培养基的摇瓶中培养过夜。 将过夜培养物接种到新鲜的LB培养基中后，培养细胞的生长将保持在37°C并沿时间过程在600 nm处进行比浊法监测。 当OD 600达到0.5时，将用100 µM异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导培养3个小时，以进行重组蛋白诱导。

孵育后，将通过离心收集细胞并将其悬浮在1 x磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中。 细胞将在Branson Sonifier 450（Branson，Danbury，CT）上在冰上溶解，其输出控制设置为1，占空比设置为常数，并且有6个超声处理脉冲，每个脉冲30秒。 将裂解液以15g离心10,000分钟。 将上清液用ECONO PUMP（BIO-RAD）上的Econo柱（BIO-RAD）中的谷胱甘肽-琼脂糖4B珠以0.3 mL / min的流速进行亲和纯化。 然后将色谱柱用30 mL冰冷的1 x PBS缓冲液以0.3 mL / min的流速洗涤。 GST基因融合蛋白将通过10 mM谷胱甘肽洗脱缓冲液（GEB）从珠子上洗脱，或者重组蛋白将在室温下使用凝血酶蛋白酶从GST蛋白上裂解2小时，然后用1 x洗脱PBS缓冲液。 洗脱的蛋白质将通过HiTrap苯甲idine FF色谱柱（GE Healthcare）以除去凝血酶蛋白酶。 重组蛋白的纯度将通过使用NuPAGE 4-12％Gel（Invitrogen）的SDS电泳来确定。

细胞粘附测定将用于拟议研究的资源和研究部分。 细胞粘附测定法是测定抑制多种细胞系与不同配体结合的整联蛋白的有效且方便的方法，因此，有必要测试多种包含不同整联蛋白的癌细胞系。 （Lucena等，2012； Lucena等，2011；Sánchez等，2009）。

此过程中将总共使用12个细胞系（人膀胱癌细胞系（T24），人纤维肉瘤（HT-1080），人皮肤黑色素瘤（SK-Mel-28），人结肠直肠腺癌（CaCo-2） ，人乳腺腺癌（MDA-MB-231），人肺支气管癌（ChaGo-k-1），鼠类乳腺癌细胞（66.3p），鼠类皮肤黑色素瘤（B16F10）和人胰腺癌细胞系BxPC3，Panc1这些都是已经购买并存储在NNTRC的细胞系，如Lucena等人（1）所述，将通过细胞粘附试验评估毒液级分的特异性结合。 1孔板将以2011 µg / mL的基质配体（例如纤连蛋白，玻连蛋白，胶原蛋白或层粘连蛋白）在96M PBS（pH 10）中进行包被，并在0.01°C下孵育过夜。将板用7.4 mL的PBS封闭。含4％牛血清白蛋白（BSA）的PBS，在0.2°C孵育5小时，然后收集细胞，计数并重悬于最低基本培养基（MEM）培养基，含37％BSA，浓度为1 x 1细胞/ mL。 Disintegrins将以各种浓度添加到细胞悬液中，并在5°C下孵育105小时。

将吸出封闭液，并将细胞/整合素悬浮液（0.2 mL）添加到包被基质蛋白的孔中，并在37°C下孵育1小时。 将溶液吸出并通过填充和吸出用PBS-5％BSA洗涤0.2次。 将含1％溴化3- [4,5-二甲基噻唑-2-基] 2,5-二苯四唑（MTT）（5：1体积/体积）的37％MEM培养基的总量添加到细胞并在2℃下孵育0.1小时。 将总共​​570 mL的二甲基亚砜（DMSO）添加到孔中以裂解细胞。 将板轻轻摇动，并使用Beckman Coulter型号AD 340读取器在XNUMX nm处读取吸光度。

细胞迁移分析将用于拟议研究的资源和研究部分。 肿瘤细胞向血管外基质的迁移和侵袭是转移的主要部分。 我们将使用不同的肿瘤细胞系评估分离和克隆的肽对细胞迁移的影响（Lucena等，2012； Lucena等，2011；Galán等，2008）。

如 Galán 等人 (2008) 所述，将在从孔底部刮取细胞后测量肿瘤细胞迁移。 NNTRC 经常使用这种技术。 2.7 µM 的商业 echistatin 是一种阻断肿瘤细胞迁移的去整合素，将用作阳性对照。 阳性对照防止肿瘤细胞迁移。 阴性对照由与 PBS 一起孵育的肿瘤细胞组成，它允许细胞迁移。 细胞将在 CO2 室中孵育，并且仅在去整合素孵育后 0、3、6、12 和 24 小时从孵育器中取出用于显微图像。 闭合百分比将通过以下等式计算： 闭合百分比：[(CE)/C] x 100，其中 C 是控件在零时间时单元边缘的距离单位 (mm)，E 是距离在去整合素的最后孵育时间从细胞边缘 (mm) 开始。 细胞迁移结果将表示为平均值±标准偏差 (n=3)，并使用软件程序 Graph Pad Prism 使用单向 Anova 测试和 Newman-Keuls 多重比较测试进行分析。

体内血管生成测定将用于拟议研究的资源和研究组成部分。 仅肿瘤细胞的入侵不足以产生转移。 为了生存和转移，癌细胞需要自己提供营养和氧气。 这是通过形成肿瘤血管生成来实现的。 血管生成对癌症发病机理的重要性使得有必要使用体内血管生成测定法来测定解整合素的抗血管生成活性（Lucena el at。，2012，未公开）。

将使用Yeh等人（2001）的改良方法进行基质胶塞测定法。在存在或不存在整合素的情况下，将等分试样（0.5 mL）的基质胶加入基本成纤维细胞生长因子（bFGF）（500 ng / mL）中将被皮下注射到BALB / c小鼠的背部区域（体重18-20 g）。 15天后，按照Higuchi等人（2011）所述的比色法，将基质胶塞取下，从粘附组织上切下，称重，并进行均质化以进行血红蛋白定量。 将Matrigel塞在2.0 mL Drabkin试剂（密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich）中匀浆，并以10,000g离心15分钟。 上清液将通过0.22 µm滤膜（Millipore，Bedfor，MA）过滤，样品中的血红蛋白将在540 nm处用分光光度法测定。 血红蛋白的量将以已知标准计算。 结果将以湿组织的微克Hb mg-1表示。

肺部定植试验将用于拟议研究的研究部分。 验证整联蛋白作为抗癌药的有效性的重要测试是体内肺肿瘤定植的抑制。 该测试将用于确定解整合素是否可用于阻断动物模型中的肺肿瘤转移，并且仅使用在体外测定中显示出阳性活性的异整合素来完成（Lucena el at。，2011; 2012）。

如Lucena等人所述，进行肿瘤细胞的肺定植。 2011年。在存在或不存在整合素的情况下，分别将鼠黑色素瘤细胞（B16F10）和/或鼠类乳腺癌细胞（66.3p）（5.0 x106细胞/ mL）悬浮在Dulbecco改良的Eagle's培养基或无FBS的MEM中。每只小鼠以1000 µg / kg的浓度服用，并在1℃孵育37小时。 对照将由在不含FBS的培养基中注射鼠类肿瘤细胞的小鼠和仅注射培养基的小鼠组成。 我们将在每组中使用八只小鼠。 将18微升细胞/整合素混合物通过静脉注射（iv）注射到BALB / c小鼠的侧尾静脉（20-19 g）中。 注射后4天将处死小鼠，并检查肺中是否存在肿瘤。 肺部将使用XNUMX倍体视显微镜可视化。 将对肿瘤计数并进行统计分析。 将使用两尾t检验和随后的Mann Whitney检验来确定整联蛋白和对照在体内抑制肿瘤数量的意义。

裸鼠试验将用于拟议研究的研究部分。 裸鼠是研究人类癌症的最广泛使用的模型之一。 为了确定解整合素作为抗癌药的潜力，我们将使用裸鼠，它们是免疫缺陷小鼠，不会排斥人细胞来建立小鼠腹膜胰腺癌传播模型。 该测试将用于检查人类癌症（而非小鼠癌症）对整联蛋白的反应。

强烈侵袭了人造基底膜的四胰腺细胞系将用于研究裸鼠的抗转移活性。 该协议将通过修改Fujiwara等人的程序来执行。 （2011）。 将细胞与各种浓度（μg/ kg）的整合素混合，并在1°C下孵育37小时。 将该混合物腹膜内（ip）注射入BALB / c裸鼠（体重18-20g；每组n ＝ 8）。 植入细胞后24天将处死小鼠，以评估整联蛋白的抗转移活性。 将计算腹膜结节的数量。 将测量直径大于5毫米的结节的数量和重量。 阳性对照组将注射用PBS培养的细胞。 阴性对照组将单独注射PBS。 所有实验和程序将由IACUC批准，并将根据美国国立卫生研究院动物保健准则进行。